一、线粒体自噬原理

线粒体，作为一种双层膜半自主细胞器，是细胞重要的能量来源。它主要负责ATP的合成，并参与细胞代谢、凋亡及氧化应激反应等多种生理、病理过程。

线粒体的功能状态与线粒体膜电位、线粒体膜通透性、线粒体Ca2+浓度及活性氧水平等有着重要的关系。

当线粒体受到氧化应激、损伤或衰老影响而发生功能异常时，细胞可通过线粒体自噬(Mitochondrial autophagy, mitophagy)清除受损的线粒体，维持细胞稳态，保证机体健康。

线粒体自噬具有高度选择性，当细胞通过多种信号途径检测到线粒体状态异常，如膜电位的改变、ROS增加及形态异常等，将会启动线粒体自噬。主要通过泛素依赖性PINK1-Parkin介导的经典通路和泛素非依赖性通路。

二 、线粒体自噬机制

（1）泛素依赖性PINK1/Parkin介导的经典通路

在Ub依赖性途径中，当线粒体受损导致膜 电位下降和ROS上升时，胞质中的Parkin蛋白被大量招募并定位于线粒体外膜，随后被激活。激活后的Parkin利用其自身含有的E3泛素连接酶活性，催化泛素链在线粒体膜蛋白上富集，从而启动线粒体自噬。

泛素链接着招募自噬受体蛋白，自噬受体蛋白与一些蛋白复合物结合，进一步招募自噬体相关蛋白如ATGA家族，通过与LC3的相互作用介导自噬小体的形成，逐渐形成自噬体膜，将受损的线粒体包裹起来，与细胞中的溶酶体结合形成自噬溶酶体进行降解，其他E3泛素连接酶如SMURF1、MUL1和Gp78也参与调节线粒体自噬。

（2）泛素非依赖性受体介导的线粒体自噬

Ub非依赖性途径则不依赖于泛素化过程。例如，NIX和BNIP3等蛋白可直接位于线粒体外膜，与LC3结合，促进自噬体形成。FUNDC1也在缺氧条件下介导线粒体自噬。

三、线粒体自噬的检测方法

（1）电镜TEM

直接观察线粒体自噬体的形成和溶酶体融合的情况

（2）免疫荧光：Mito-tracker与LC3/Lyso-tracker

通过转染LC3-GFP过表达载体质粒，并使用特定的线粒体荧光探针来标记线粒体（如Mitochondrial Tracker (Red)），共聚焦显微镜下观察共定位情况从而评估线粒体自噬的发生。

（3）Western blot：线粒体相关蛋白

• 线粒体蛋白/总蛋白：TOMM20（外膜）、TIMM50（内膜）、PINK1/PRNK、Drp1、MFN1/2、OPA1、Cytochrome c。

• 自噬相关蛋白：Beclin1、P62、LC3 II/I、LAMP1。

• Mito-keima。

其他

• 活细胞染色评估线粒体状态：JC-1/TMRM/DilC1(5)，MitoSOX等。

• qPCR检测mtDNA。

• 线粒体氧化磷酸化。

• 评估细胞状态：CCK8，EDU，PI，Hoechst，SYTOX，细胞死亡表型检测。

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